Основными в этиологической лабораторной диагностике микозов до настоящего времени продолжают оставаться классические методы, включающие микроскопию материала, выделение чистой культуры возбудителя с последующей его идентификацией. Иммунологические методы диагностики имеют вспомогательное значение. Они используются для выявления наиболее значимых возбудителей: патогенных диморфных грибов, а также возбудителей криптококкоза, кандидоза и аспергиллеза. Методы геноиндикации (полимеразная цепная реакция) также имеют ограниченное применение ввиду их недостаточной специфичности, но применяются преимущественно при диагностике глубоких и оппортунистических микозов.
Материалом для исследования при лабораторной диагностике микозов в зависимости от формы заболевания могут быть: кожа и ее придатки (волосы, ногти), отделяемое ран и свищей, мокрота, кровь, ликвор и моча, тканевые биоптаты. Правильностью взятия патологического материала во многом определяется эффективность дальнейшего лабораторного исследования. При кожных поражениях материал отбирается чаще всего методом соскобов или с использованием липкой ленты (преимущественно при поверхностных формах) до лечения из свежих, но полностью развившихся очагов по периферии, где находятся наиболее жизнеспособные возбудители.
При выявлении грибов-дерматофитов чрезвычайно информативным материалом являются волосы, поскольку характер поражения волос позволяет идентифицировать возбудителя. Определению очага поражения в ряде случаев помогает использование лампы Вуда. Пораженные волосы вместе с чешуйками извлекаются эпиляционным пинцетом. При хронической черноточечной трихофитии волосы извлекают из кожи препарировальной иглой.
Ногти отбирают на протяжении всех слоев, срезая острым скальпелем или ножницами. Более эффективен отбор с использованием зубного бура. При кандидозных поражениях материал отбирается с помощью соскоба с ногтевого валика. Отобранный материал доставляется в лабораторию в пакетах из темной бумаги, чтобы избежать высыхания и контаминации посторонней микрофлорой. Материал, содержащий гной, доставляется в стерильных бакпечатках или чашках Петри. Мокрота отбирается в стерильную посуду. Исследование мокроты должно быть проведено не позднее 2 ч после сбора. При удлинении сроков исследования образцы должны храниться в холодильнике при + 4 °С, в противном случае могут возникнуть диагностические ошибки, связанные с появлением псевдомицелиальных форм дрожжевых клеток.
Кровь и спинномозговая жидкость отбираются с соблюдением правил асептики. Посев крови осуществляется в жидкую среду Сабу- ро. Для исключения контаминации образцов крови проводят их повторные исследования. Спинномозговую жидкость центрифугируют, а осадок используют для микроскопирования и посева.
Моча отбирается утром в стерильную посуду, при этом необходимо избегать загрязнения материала микрофлорой кожи промежности. Посев мочи осуществляется с использованием количественных методов посева.
В диагностике микозов используются препараты как из нативного материала, так и окрашенные. При исследовании неокрашенных препаратов плотный материал предварительно просветляют (мацери- руют) 10-30% раствором КОН (можно использовать растворы диметил сульфоксида), а затем микроскопируют по методу «раздавленной капли». Для придания контрастности препараты прокрашивают водным раствором метиленового синего.
Окраску фиксированных мазков осуществляют различными способами: по Граму, метиленовым синим, по Романовскому - Гим- зе. Последний способ позволяет увидеть мелкие дрожжевые клетки и стадии фагоцитоза. Для криптококков используют окраску тушью, окраску с муцикармином по Саутгейту. Меланинсодержащие грибы (темноокрашенные), например Cladophialophora bandana , окрашивают по Массой - Фонтана (окраска меланина, входящего в состав клеточной стенки). Флюоресцирующие сыворотки используются при диагностике возбудителей глубоких микозов, возбудителей дерматофи- тии, грибов рода Candida.
Выделение чистой культуры возбудителя дает возможность установить родовую и видовую принадлежность гриба, изучить его свойства и чувствительность к антимикробным препаратам. Для выделения и идентификации грибов используют плотные и жидкие питательные среды Сабуро, сусло-агар. Эти среды обеспечивают рост большинства патогенных и условно-патогенных грибов. Кроме того среда Сабуро (рис. 8.2) стимулирует процессы пигментообразования у грибов, что имеет значение при идентификации.
Для подавления роста бактерий-контаминантов в среды добавляют антибиотики: левомицетин, стрептомицин, пенициллин, тетрациклин. Для выделения прихотливых патогенных грибов используют среды, обогащенные кровью и сердечно-мозговым экстрактом. Специальные среды используют для культивирования и идентификации грибов: среда Чапека - для формирования конидий при идентификации плесневых грибов, картофельный (картофельно-морковный) агар, рисовый агар - для выявления типов роста и получения хламидоспор при идентификации грибов рода Candida , морковный (овощной) агар - для получения типичных колоний культуры гриба Trichophyton schonleini, среда Кашкина - для выделения пигментообразующих грибов. Используются и дифференциально-диагностические среды, например, для идентификации С. albicans - хромогенные среды или среды, позволяющая определить фосфолипазную активность гриба.
Время инкубации грибов составляет от нескольких суток до 1 месяца и более. При подозрении на патогенные диморфные грибы для выдачи отрицательного ответа культивирование проводится в течение 8 недель.
Посевы проводят на среды, разлитые по пробиркам, флаконам и чашкам Петри. Посевы материала на грибы-дерматофиты осуществляют одновременно на несколько пробирок со средой. Материалы, подозрительные на содержание плесневых грибов (мокрота), засевают в 3 точки и инкубируют при 28 и 37 °С. Для решения вопроса об отсутствии контаминации при заборе материала осуществляют контрольные посевы воздуха на содержание плесневых грибов в помещениях лаборатории и палатах, где находятся больные.
При культивировании грибов в микологической лаборатории соблюдаются меры безопасности, аналогичные таковым в бактериологических лабораториях. Работу с плесневыми грибами и микотоксинами во избежание аллергизации персонал проводит в боксированных помещениях в марлевых повязках или в настольных боксах с вытяжкой. Работа с культурами, относящимися ко II группе патогенности (патогенные диморфные грибы), возможна только в специализированных лабораториях.
Идентификация видов грибов проводится на основании комплекса культуральных, морфологических и других признаков. К первым относятся морфология колонии, ее окраска и размеры при культивировании на специальных средах, строение края и центра, характер поверхности, наличие и характер репродуктивных органов, ко вторым - особенности микроскопического строения мицелия, строение, форма и размеры репродуктивных органов - конидиеносцев, конидий, хламидоспор, артроспор и т.д.
Грибы формируют различные типы колоний на плотных питательных средах. Ученые из института Г. Вентера (США), учитывая способность грибов выделять в среду пигментные вещества, создали в питательной среде «новогоднюю елку» (рис. 8.3).
Рис. 8.3. «Новогодняя елка» из грибов (верхушка: Talaromyces stipitatus ; дерево Aspergillus nidulans; украшения: Penicillium marneffei; пенек: Aspergillus terreus)
Ферментативные и ассимиляционные способности культур имеют большое значение при идентификации дрожжей (дрожжеподобных грибов). В настоящее время для идентификации часто встречающихся грибов - возбудителей заболеваний человека и животных - применяются коммерческие тест-системы: BBL Mycotube, API 20С bio Merieux и др.
Основой диагностики грибковых заболеваний является микроскопическое исследование препаратов, приготовленных из пораженных участков кожи и ногтей. Однако микроскопическая картина при разных видах микозов сходная: в кожных чешуйках и ногтях видны споры грибков и ветвистый септированный мицелий диаметром 4-7мкм. Поэтому род и вид гриба в большинстве случаев не может быть определен по микроскопической картине в кожной чешуйке или в соскобе с ногтя. Для идентификации возбудителя проводят посевы на питательные среды, чаще всего на среду Сабуро.
Эпидермофития. Поражается роговой слой кожи, чаще всего стоп, и ногти нижних конечностей. Волосы никогда не поражаются. На ногтях появляются желтые пятна или полосы, затем развивается гиперкератоз (утолщение ногтей), их деформация и разрушение. На коже стоп появляется пластинчатое шелушение подошв и межпальцевых складок, покраснение. Иногда образуются пузыри, опрелости, трещины. Заболевание сопровождается зудом, жжением, болезненностью.
При микроскопическом исследовании соскобов, чешуек, покрышек пузырей определяются малосептированные нити мицелия диаметром 3-5мм, часть нитей распадается на круглые и прямоугольные споры.
Трихофития. Это грибковое заболевание кожи и ее придатков с особой склонностью поражать волосы [лат. trichos волос + phyton грибок]. На волосистой части головы появляются многочисленные очаги поражения диаметром около 1,5см. Кожа на них отечная, гиперемирована, покрыта чешуйками. Волосы в очагах обламываются на уровне 2-3мм над поверхностью кожи, откуда и название «стригущий лишай».
Микроскопическое исследование выявляет характерную особенность грибов вида трихофитон - расположение их спор цепочками. В зависимости от свойств грибов различают:
Endothrix (возбудитель поверхностной трихофитии). Грибы растут внутри волоса, резко изменяя его структуру. Весь волос заполнен (нафарширован) параллельными рядами цепочек, состоящих из крупных округлых или квадратных спор;
Ectothrix (возбудитель глубокой трихофитии), при котором волос окутан чехлом из мелких или крупных спор, расположенных вдоль оси цепочками.
Фавус – парша. Поражаются волосы и кожа, реже – ногти. Волосы становятся тонкими, тусклыми, «припудренными», как старинные парики, но не обламываются. Для поражения кожи характерно появление корочек желто-серого цвета (щитков) с приподнятыми, как у блюдцев, краями.
При микроскопическом исследовании выявляются пузырьки воздуха внутри пораженного волоса.
Микроспория. Поражаются кожа и волосы. В очагах поражения волосы обламываются на уровне 6-8мм над поверхностью кожи. Вокруг оставшихся пеньков заметны беловатые чехлы.
При микроскопическом исследовании пораженных волос видны споры, располагающиеся вокруг и внутри волоса мозаично (беспорядочно). Они очень мелкие (1-3мм), отсюда и название болезни. Диагностике микроспории помогает характерное люминесцентное свечение волос.
При микроскопическом исследовании обнаруживают округлые почкующиеся клетки, часто в виде виноградной грозди.
Глубокие (плесневые) микозы. Чаще встречаются как профессиональные заболевания на предприятиях по производству антибиотиков, у сельскохозяйственных рабочих, контактирующих с заплесневевшим зерном, сеном, компостом и т.д. Возбудитель пенициллиоза (гриб-кистевик) имеет грубый, широкий, септированный мицелий, заканчивающийся кисточкой. Возбудитель мукороза имеет широкий несептированный мицелий, заканчивающийся сумкой со спорами. Возбудитель аспергиллеза (леечная плесень) часто содержится на заплесневевших фруктах, хлебе. Имеет грубый септированный мицелий, заканчивающийся расширением, от которого отходят нити со спорами, напоминающими лейку со струйками воды.
Актиномикоз. Вызывается разными видами лучистого грибка. Характеризуется образованием на коже, слизистых оболочках и во внутренних органах плотных инфильтратов, склонных к нагноению и появлению свищей. На глаз в отделяемом свищей видны мелкие желтые зернышки с характерным лучистым краем – друзы актиномицета. Препараты для микроскопии готовят из отделяемого свищей и мокроты.
При малом увеличении друзы лучистого грибка имеют вид желтоватых образований округлой формы со светлой аморфной серединой и более темной окраской по краям. При большом увеличении в центре друзы определяются нити мицелия, а по периферии – колбовидные вздутия. При окраске по Граму нити мицелия Г+, а колбочки Г-.
4402 0
К сожалению, и в настоящее время можно констатировать, что диагностика грибковых заболеваний нередко бывает несвоевременной (зоны поредения волос, шелушение часто принимаются за «перхоть», «сухость»). При этом субьективные ощущения (зуд, боль и др.) в очагах поражения зачастую не бывают, и больные в силу этого долгое время не обращаются на прием к специалисту.
Изменения ногтей (уродливые, крошатся, истонченные) расцениваются как «ониходистрофии» после ушиба, отморожений и др. В то же время (даже изолированные поражения, в т.ч.ногтей) могут вести к формированию аллергической перестройки организма, влиять на кровеносные и лимфатические сосуды и др. Больные при этом неопределенно долго остаются источником распространения грибковой инфекции. В связи со сказанным неизменно актуальной является своевременная лабораторная диагностика микозов, проведение возможно раннего лечения.
Разнообразие клинических вариантов грибковых заболеваний, преимущественно встречающихся у человека, а также особенности микробиологии, морфоструктуры, иммунологических и иных параметров различных видов(и родов) грибов обусловило наличие значительного количества методов диагностики микозов; следует отметить, что имеющиеся методы непрерывно совершенствуются и (сравнительно недавно) имеют своеобразный уклон в сторону иммунологических и молекулярно-генетических тестов.
С другой стороны, культуральные исследования и до сих пор «находятся в разряде стандартов, близких к золотым» и применяются для подтверждения сомнительных результатов иных исследований; существует мнение, что сочетание культурального и молекулярно-генетического методов при «сомнительных» в диагностическом плане формах микозов (особенно диссеминированных, на фоне иммуносупрессии любого генеза, с поражением внутренних органов и др.) является одним из наиболее достоверных способов регистрации микотической природы процесса.
Не следует, однако, пренебрегать «старыми» методиками, в частности бактериоскопией (особенно припервичном обследовании), тем более, что в повседневной практике микроскопическая «верификация» микоза во многих дерматологических учреждениях применяется наиболее широко в сравнении с иными тестами.
С учетом значительного роста количества аллергических проявлений на коже (а иногда и висцеральных) — при длительном, хроническом, периодически обостряющемся течении микоза (кожи, ногтей и др.) целесообразна постановка аллергологических тестов, позволяющих выявить степень сенсибилизации организма, в т.ч, при сочетанной грибково-бактериальной инфекции; данный факт может повлиять на специфику лечения у конкретного больного — например, определить рациональное назначение антимикотиков и десенсибилизирующих средств и др.
Традиционно, предположительный диагноз грибкового заболевания ставится на основании клинических проявлений и подтверждается лабораторными исследованиями.
В данном разделе книги мы кратко приводим базовые методы регистрации микозов (независимо от их локализации), учитывая «тип исследования и взятый материал». Следует отметить, что полиморфизм клинических проявлений микозов (в т.ч. с аллергическим компонентом) обусловливает разнообразие патологического материала, подлежащего исследованию. При этом успех поиска элементов гриба зависит от правильного взятия его.
Так, периферическая зона эритемато-сквамозных, часто фигурных высыпаний более богата мицелием, спорами гриба; на волосистых участках поражения берутся скрюченные, белесоватые, обесцвеченные, тусклые волосы или их обломки — «пеньки» (забор волос целесообразно контролировать с помощью лампы Вуда). Определенных навыков требует забор материала (с помощью иглы) из т.н. «черных точек» — темных роговых конусов в устьях фолликулов.
В повседневной практике обычно исследуются чешуйки кожи(собираются путем соскоба, мазка, с использованием липкой ленты), соскоб измененных ногтей, зона подногтевого гиперкератоза, а также отделяемое слизистых оболочек. По показаниям исследуют мокроту, лаважную жидкость, мочу (у пациентов с некатетеризированным мочевым пузырем); моча из мочеприемников, подкладных суден не может быть взята для исследования.
Диагностическое значение имеет также кровь (для культурального исследования, а также ИФА, ПЦР), ликвор и иные биожидкости организма (плевральная, внутрисуставная, внутрибрюшинная — в т.ч. собранные методом аспирации или дренирования); в отдельных случаях (в зависимости от топического диагноза) имеют значение желчь, фекалии, пунктаты подкожных абсцессов, отделяемое свищей (особенно при глубоких микозах). Даже несложные диагностические тесты требуют точного соблюдения ряда условий.
Для диагностики грибковых заболеваний в настоящее время применяются методы:
- микроскопия; основана на обнаружении возбудителя в исследуемом материале, в т.ч. в тканях человека;
- культуральное исследование с последующим микроскопическим изучением культуры гриба;
- гистологическое исследование (г.о. при глубоких микозах);
- иммунные и молекулярные методы.
Микроскопическая диагностика
Микроскопическая диагностика — стала возможна с периода появления специальной оптической, а в дальнейшем электронно-микроскопической техники, позволившей детально изучить ульттраструктуру грибов. При этом диагностическое значение имеет обнаружение элементов гриба - тонких ветвящихся нитей, образующих грибницу (мицелий), округлых телец (споры; являются репродуктивным «органом» грибов).Микроскопическая диагностика предполагает изучение неокрашенных (нативных) и окрашенных препаратов. Данный метод, как отмечалось, более всего распространен в дерматологической практике ввиду сравнительной несложности и дешевизны, но, с другой стороны, бывает недостаточно чувствительным, требует в части Случаев повторных анализов, подтверждения иными методиками.
Так, при исследовании неокрашенных препаратов помимо элементов гриба, можно обнаружить эпителиоциты, клетки крови,различные загрязнения из внешней среды, что затрудняет поиск возбудителя микоза, требует дополнительной «подготовки» материала — т.н. «просветления» его (мацерации), концентрирования, разведения и т.п.
Все же прямая микроскопия нативных препаратов позволяет достаточно быстро поставить диагноз микоза, определить, на какие питательные среды (при необходимости) следует засевать материал, существует мнение, что положительный результат ее может оставаться единственным лабораторным подтверждением микоза при отрицательном ответе в культуре (А.Ю.Сергеев, Ю.В.Сергеев, 2003).
Среди различных вариантов «просветления» препаратов наиболее распространенным является добавление к исследуемому материалу КОН или NаОН (чаще используется для обнаружения грибов в чешуйках кожи, волосах, а также ряда возбудителей глубоких микозов в мокроте, биоптатах).
Для мацерации измельченных и помещенных на предметное стекло чешуек проводится 10-20% раствором едкого натра (или калия) — 1-3 капли, в течение 10-20 мин; препарат слегка придавливают покровным стеклом, для более скорой мацерации — подогревают на пламени до появления паров. Просмотр ведут сначала под малым увеличением, затем — под большим (сухая система).
Правильно приготовленный препарат, не подвергшийся грубым механическим, термическим и химическим воздействиям, представляет картину гомогенной массы, состоящей из эпителиоцитов, продуктов клеточного распада элементов гриба — нитей мицелия и спор.
Измененные волосы помещают на предметное стекло с 10-30% щелочью и обрабатывают тем же способом, но более длительно - от 20 мин до 3-4 ч. При обильном содержании пигмента рекомендуют предварительно обесцветить волосы 5% раствором перекиси водорода. Придают значение обнаружению элементов гриба, а также расположению их по отношению к волосу.
Подготовка материала из патологически измененных ногтей (лучше тонкий порошок, полученный соскобом из глубины очага) проводится аналогично, но с использованием 30% едкого натра, обязательным осторожным подогреванием на пламени до легких паров и экспозицией около 1ч (иногда до нескольких часов). Обработанные щелочью препараты не следует хранить более 1,5-2ч ввиду их «порчи» (кристаллизация реагента, снижение диагностической достоверности определяемой микроскопической картиной).
Вместо КОН или №ОН можно использовать: а)раствор смесь КОН с 15% ДМСО; б) смесь фенола (2 части) с хлоралгидратом (2 части) и молочной кислотой (1 часть); в) калькофлюоровый белый, имеющий сродства к хиги-ну и целлюлозе; для исследования необходим люминесцентный микроскоп (наблюдается голубое или зеленое свечение, что зависит от применяющегося фильтра). При исследовании ликвора (при подозрении на криптококкоз) часто использовалась окраска с тушью.
Кулага В.В., Романенко И.М., Афонин С.Л., Кулага С.М.
Болезни, вызванные грибками или микозы, являются распространенной проблемой. Возбудителей микозов насчитывается невероятное количество.
Ежегодно открываются учеными и описываются новые виды грибков. Несмотря на это, диагностика и лечение микозов - давно отлаженный и четкий механизм.
Виды грибковых заболеваний
У человека большинство грибков поражают слизистые оболочки и кожу.
К болезням, при которых причиной развития заболевания являются грибки, относятся:
- дерматомикоз
- кандидоз
- онихомикоз
- пёстрый или отрубевидный, разноцветный лишай
- чёрный лишай
- себорея
- аспергиллёз
Методы диагностики микозов
Одна из самых популярных методик - микробиологическая диагностика микозов.
/IMG_7144_old.jpg)
Современные методы диагностики позволяют точно определить, какой грибок был причиной возникновения болезни. В дальнейшем, это дает возможность подобрать оптимальный курс лечения. На данный момент существует три основных метода лабораторной диагностики микозов.
К ним относятся:
- микроскопический
- культуральный
- серологический
Каждый из методов имеет свои преимущества. Культуральная диагностика микозов позволяет определить вид грибков. При этом есть возможность оценить чувствительность колоний к различным препаратам.
Подобный метод позволит подобрать эффективный препарат. Данный способ требует много времени на посев и выращивание колоний.
Микроскопический и серологические методы диагностики микозов требуют меньше времени на проведение. При их использовании тоже определяется вид возбудителя, но проверить его чувствительность к препаратам невозможно. В некоторых случаях возможно использование люминесцентного метода диагностики. Данный метод менее распространен ввиду его сложности.
Люминесцентный метод возможно применять лишь при поражении грибками волос. Метод малоэффективен для диагностики на ранних стадиях. Это обусловлено тем, что эффект свечения будет проявляться лишь при обильном поражении грибком волос.
Диагностика микоза стопы
Микоз стопы является одним из наиболее распространенных дерматомикозов.
Под этим термином принято понимать грибковое поражение кожи стопы и ногтей.
Помните! Заболевание отличается рецидивирующим течением.
Во время диагностики микоза стопы необходимо провести дифференциацию с рядом иных заболеваний. Диагностика микоза стопы базируется на клинических проявлениях и микроскопическом исследовании. Возможно применение культурального метода.
Лечение микозов
Ведущую роль в лечении микозов составляют противогрибковые препараты местного и системного действия.
Лечение местными антимикотиками направлено непосредственно на очаг заболевания. При этом негативное воздействие на организм в целом является минимальным.
Противомикозные препараты системного действия назначают, если:
- местные противогрибковые препараты малоэффективны
- заболевание имеет системный характер
Десенсибилизирующее и антигистаминные препараты назначают, когда микозы сопровождаются воспалительным процессом или аллергическими реакциями. Если к микозам присоединяется вторичная инфекция, возможно назначение антибактериальных препаратов.
Лечение грибковых заболеваний важно начинать на ранних стадиях болезни. Если процесс давний, для лечения может потребоваться больше времени.
При появлении первых симптомов незамедлительно обращайтесь за помощью к нашему врачу.
Прецизионная диагностика инвазивных микозов нелегка. Это объясняется не только трудностями в получении культуры грибов, но и в интерпретации результатов исследований, поскольку грибами, как дрожжевыми, так и мицелиальными, возможны колонизация слизистых оболочек, контаминация исследуемых образцов. В связи с этим диагностика инвазивных микозов базируется на комплексном подходе, включающем не только результаты микологических (культуральных) и серологических (определение антигена грибов) исследований, но и клинические симптомы грибковой инфекции, данные вспомогательных методов исследований (компьютерная или магнитно-резонансная томография, ультразвуковое исследование).
Европейско-американской кооперированной группой по изучению инвазивных микозов у иммунокомпрометированных больных разработаны критерии диагностики инвазивных микозов. Они представлены в 2001 г. на Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (ICAAC, Chicago), а в 2002 г. в печати. Определены критерии доказанного, вероятного и возможного инвазивного микоза, которые рекомендуется использовать при клинических и эпидемиологических исследованиях
Доказанный инвазивный микоз, вызванный мицелиальными грибами : обнаружение мицелия грибов в биоптатах либо аспиратах при гистологическом или цитологическом исследовании или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи и со слизистых оболочек.
Доказанный инвазивный микоз, вызванный дрожжевыми грибами : обнаружение дрожжевых клеток (грибы рода Candida могут формировать псевдомицелий или истинный мицелий) в биоптатах или аспиратах, за исключением образцов со слизистых оболочек, или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи, образцов из пазух носа и со слизистых оболочек, или обнаружение при микроскопии и специфическом окрашивании (в капле туши, окраска муцикармином) дрожжевых клеток либо положительного антигена Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости.
Фунгемия, обусловленная мицелиальными грибами : выделение гемокультуры грибов, за исключением Aspergillus spp. и Penicillium spp., включая Penicillium marneffei, в сочетании с клиническими симптомами инфекционного процесса, совместимыми с выделенным возбудителем.
Фунгемия, обусловленная дрожжевыми грибами : выделение гемокультуры грибов рода Candida или иных дрожжевых грибов у пациентов с клиническими признаками инфекции, связанными с данным возбудителем.
Комплекс диагностических исследований при инвазивных микозах
| Исследуемый биоматериал | Показания, используемые среды, значение |
| Кровь |
Показания
:
стойкая лихорадка (4-5 дней и более) на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия; вторая «волна» лихорадки на фоне терапии антибиотиками Забор крови из вены во флаконы для аэробных бактерий* или в селективную среду для грибов, неоднократный (2-3 раза в течение суток с интервалом 1 ч) Диагностическая значимость : выделение дрожжевых грибов, осторожная интерпретация при выделении мицелиальных грибов, за исключением Fusarium spp. |
| Венозный катетер |
Показания
:
выделение дрожжевых грибов из крови Центральный или периферический венозный катетер удаляют во всех случаях выделения дрожжевых грибов из крови Для микологического исследования используют асептически удаленный дис-тальный отрезок катетера длиной 5- 6 см. Исследование проводят полуколичественным (Maki method) или количественным методом на среде Сабуро Диагностическая значимость
:
|
| Отделяемое верхних дыхательных путей, мокрота, смывы из трахеи, бронхов, жидкость бронхоальвеолярного лаважа |
Показания
:
подозрение на микозы, вызванные мицелиальными грибами или Cryptococcus neoformans; длительная лихорадка на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия и нейтропении Микроскопия образцов с калькофлуором белым (обнаружение мицелия или псевдомицелия); посев на среду Сабуро; определение антигена Aspergillus в жидкости бронхоальвеолярного лаважа при наличии очагов в легких, характерных для инвазивного аспергиллеза Диагностическая значимость : выделение мицелиальных грибов или Cryptococcus neoformans |
| Цереброспинальная жидкость |
Показания
:
симптомы менингита; обнаружение очага (очагов) в головном мозге при компьютерной или магнитно-резонансной томографии; «мозговая» симптоматика на фоне лихорадки и нейтропении Микроскопия с калькофлуором белым, в капле туши; определение антигена Aspergillus, Cryptococcus; посев на среду Сабуро Диагностическая значимость
:
|
| Биоптаты, аспираты, перитонеальная жидкость, плевральная жидкость |
Показания
:
клинические и/или радиологические признаки инвазивного микоза; лихорадка на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия. Микроскопия с калькофлуором белым, посев на среду Сабуро Диагностическая значимость
:
|
Вероятный инвазивный микоз
диагностируют при совокупности следующих критериев:
один признак из категории микробиологических критериев;
один признак из категории «значимых» или два из группы «менее значимых» клинических симптомов инфекционного процесса.
Возможный инвазивный микоз
диагностируют на основании совокупности следующих критериев:
наличие хотя бы одного фактора риска, индуцирующего развитие инвазивного микоза;
один признак из категории микробиологических критериев или один признак из категории «значимых» (два из группы «менее значимых») клинических симптомов инфекционного процесса.
Понятие «возможный инвазивный микоз » не рекомендуется использовать в клинических исследованиях по изучению эффективности протигрибковых препаратов. Можно пользоваться этим термином при анализе эмпирической противогрибковой терапии, эпидемиологических исследований, изучении фармакоэкономики.
При микологическом исследовании стерильных аспиратов или биоптатов принимают во внимание выделение не только культуры грибов, но и обнаружение при микроскопии мицелия или псевдомицелия. В гистологических препаратах аспергиллы трудно дифференцировать от Fusarium spp., Sceclosporium apiospermum и некоторых других мицелиальных грибов. Для дифференциальной диагностики следует проводить иммуногистохимическое исследование с антителами к аспергиллам.
Выделение дрожжевых грибов
из крови хотя бы в одном исследовании относится к категории «доказанного» инвазивного микоза и является абсолютным показанием к назначению системных антимикотиков больным с нейтропенией. Частота выявления дрожжевых грибов из крови невысокая, даже при диссеминированном кандидозе она составляет 35-50 %.
Проведение повторных посевов крови
повышает вероятность получения положительных результатов.
Иная интерпретация результатов в случае обнаружения мицелиальных грибов в крови. Высокая частота выделения мицелиальных грибов характерна для Fusarium spp. и составляет 40-60 %. Aspergillus обнаруживают крайне редко, в большинстве случаев это рассматривается как контаминация, за исключением Aspergillus terreus.
Выделение Aspergillus terreus из крови больных с гемобластозами может свидетельствовать об истинной аспергиллемии, а при наличии клинических симптомов инфекции является основанием для назначения антимикотиков.
Критерии инвазивного микоза
| Показатель | Критерии |
| Факторы, индуцирующие возникновение инвазивного микоза (макроорганизм) |
Нейтропения (< 0,5*109/л в течение 10 дней)
Персистирующая лихорадка в течение более 96 ч на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия Температура тела выше 38 °С или ниже 36 °С и любой из следующих предрасполагающих признаков: длительная нейтропения (более 10 дней) в течение предыдущих 60 дней, интенсивная им-муносупрессивная терапия в течение последних 30 дней, доказанный или вероятный инвазивный микоз в предыдущий период нейтропении либо СПИД Наличие симптомов РТПХ, прежде всего случаи тяжелого течения (II степени) или экстенсивное течение хронической болезни Длительное (более 3 нед) применение глюкокортикоидов в течение последних 60 дней |
| Микробиологические признаки |
Выделение культуры мицелиальных грибов (включая Aspergillus spp., Fusaruim spp., Sceclosporium spp. и зигомицеты) и Cryptococcus neqformans из мокроты или жидкости бронхоальвеолярного лаважа
Положительные результаты культурального или цитологического исследования (прямой микроскопии) по обнаружению мицелиальных грибов из аспиратов придаточных пазух носа Обнаружение мицелиальных грибов или Cryptococcus neoformans при цитологическом исследовании/ прямой микроскопии из мокроты или жидкости бронхоальвеолярного лаважа Положительный антиген Aspergillus в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, цереброспинальной жидкости и образцах крови (не менее двух) Положительный антиген криптококка в образцах крови Обнаружение при цитологическом исследовании или прямой микроскопии элементов грибов в образцах стерильных в норме жидкостей (например, Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости) Два положительных результата исследований по обнаружению культуры дрожжевых грибов в моче при отсутствии мочевого катетера Кристаллы Candida в моче при отсутствии мочевого катетера Выделение Candida spp. из гемокультур |
|
Клинические признаки
Нижние дыхательные пути |
Должны быть сопряжены с локусом, откуда берут образцы для микробиологического исследования
Любой из следующих типов новых инфильтратов в легких по данным КТ: симптом «ореола», симптом «полумесяца», полость с участками консолидации* Симптомы инфекции нижних дыхательных путей (кашель, боль в грудной клетке, кровохарканье, диспноэ), шум трения плевры, любой новый инфильтрат, не включенный в признаки высокой степени значимости; плевральный выпот |
|
Верхние дыхательные пути
Признаки высокой степени значимости Признаки меньшей степени значимости |
Радиологические признаки инвазивной инфекции в пазухах носа (эрозия стенки или распространение инфекции на прилежащие структуры, экстенсивная деструкция костей черепа) Насморк, заложенность носа, изъязвления слизистой оболочки носа, носовое кровотечение, периорбитальный отек, боль в области верхней челюсти, некротические изъязвления черного цвета или перфорация твердого неба |
|
Центральная нервная система
Признаки высокой степени значимости Признаки меньшей степени значимости |
Рентгенологические признаки предполагаемой инфекции ЦНС (мастоидит или другой параменингеальный фокус, экстрадуральная эмпиема, множество очагов в веществе головного или спинного мозга) Фокальные неврологические симптомы и признаки, включая фокальные судороги, гемипарез; расстройства сознания, менингеальные симптомы, нарушения биохимического состава цереброспинальной жидкости и ее клеточного состава (при отсутствии других возбудителей, по данным культурального исследования и микроскопии, при отсутствии опухолевых клеток) |
При выявлении в крови или иных стерильных биосубстратов дрожжевых грибов обязательно следует проводить идентификацию до вида и определять чувствительность к противогрибковым препаратам, при выделении мицелиальных (плесневых) грибов - только идентификацию до вида, чувствительность не определяют.
В клинической практике чувствительность мицелиальных грибов не исследуют по причине несовершенства стандартов по определению чувствительности таких грибов к антимикотикам. Более того, только в одном исследовании продемонстрирована корреляция между чувствительностью Aspergillus spp. и результатами лечения инвазивного аспергиллеза у больных с гемобластозами. Ни в одном из исследований, проведенных в последующем, не получено подобных результатов.
В последнее время стали появляться единичные сообщения о формировании приобретенной резистентности грибов A. fumigatus к итраконазолу, вориконазолу.
Идентификация грибов до вида , особенно полученных из стерильных локусов, необходима прежде всего для выбора антимикотика и проведения адекватной противогрибковой терапии. Так, Candida krusei устойчивы к флуконазолу и менее чувствительны, чем дрожжевые грибы другого вида, к амфотерицину В; Aspergillus terreus, Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boydii), Trichosporon beigelii, Scopulariopsis spp. резистентны к амфотерицину В; Mucorales резистентны к итраконазолу, вориконазолу, Candida glabrata проявляет дозозависимую чувствительность к флуконазолу, и при выделении этого вида гриба, даже чувствительных штаммов, дозу флуконазола следует увеличить (взрослым назначают 800 мг вместо 400 мг); Candida lusitaniae устойчивы к амфотерицину В.
Идентификация грибов до вида также важна для проведения эпидемиологического анализа в стационаре - определения возбудителей вспышек инфекции и по возможности источника инфекции. Описаны вспышки инфекции, вызванные такими редкими грибами, как С. lusitaniae, С. krusei, С. lipolytica.
На основании видовой идентификации грибов можно предположить инвазивный микоз или колонизацию грибами слизистых оболочек. Например, Aspergillus niger существенно реже, чем Aspergillus fumigatus, являются причиной инвазивного аспергиллеза у больных острыми лейкозами. Выделение из жидкости бронхоальвеолярного лаважа Aspergillus niger чаще всего расценивается как колонизация дыхательных путей, а из мокроты - как контаминация из воздуха и требует дополнительных исследований при подтверждении диагноза инвазивного аспергиллеза.
На основании выделения мицелиальных грибов из мокроты, бронхоальвеолярной жидкости, аспирата околоносовых пазух можно только предполагать инвазивный микоз, не включая его в категорию «доказанного». Тем не менее обнаружение Aspergillus в мокроте, особенно Aspergillus fumigatus или Aspergillus flavus, у пациентов с нейтропенией, реципиентов аллогенного костного мозга всегда должно быть принято во внимание. Это требует повторного проведения микологического исследования и компьютерной томографии легких. Так, при нейтропении вероятность выявления инвазивного аспергиллеза в случае положительной культуры Aspergillus spp. в мокроте составляет 80 %.
Выделение Cryptococcus neoformans у иммунокомпрометированных больных из респираторного тракта (смывы, лаваж) является диагностически значимым. Если идентификация дрожжевых грибов из жидкостей, полученных из дыхательных путей (смывы из трахеи, бронхов, бронхоальвеолярный лаваж) иммунокомпрометированных больных, не относится к обязательным исследованиям, то проведение скрининга по выявлению Cryptococcus neoformans из этих образцов является необходимым.
Обнаружение кандид в моче у больных с нейтропенией и лихорадкой, как правило, считается проявлением диссеминированной кандидозной инфекции.
В своевременной диагностике инвазивного успешно пользуются коммерческим тестом по выявлению циркуляции специфического антигена грибов Aspergillus spp. галактоманна (полисахаридный водорастворимый компонент клеточной стенки гриба).
Галактоманн может быть определен двумя методами: методом латекс-агглютинации (Pastorex Aspergillus, фирмы BioRAD) и методом иммуноферментного анализа (Platelia Aspergillus, фирмы BioRAD).
Преимуществом иммуноферментного метода является более низкий порог чувствительности определения уровня галактоманна в крови - 1 нг/мл и менее, а с помощью латекс-агглютинации - 15 нг/мл. Диагностическое значение имеет определение галактоманна в крови (не менее чем в 2 образцах), цереброспинальной жидкости, бронхоальвеолярном лаваже. Чувствительность метода иммуноферментного анализа составляет около 90 %, специфичность 90-99 %, у реципиентов аллогенного костного мозга данные показатели ниже и равны соответственно 60-70 % и 80-90 % вследствие профилактического применения противогрибковых препаратов (антимикотики снижают пороговый уровень галактоманна).
В 40 % случаев выявление галактоманна в крови опережает проявления инвазивного аспергиллеза, определяемые при компьютерном исследовании легких, а в 70 % опережает клинические симптомы инфекции.
Диагностическую значимость тест по выявлению антигена Aspergillus имеет в том случае, если исследование проводят неоднократно. Определение антигена Aspergillus в крови следует проводить при лихорадке на фоне лечения антибиотиками широкого спектра действия у больных с нейтропенией 2 раза в неделю; при пневмониях, которые возникают или сохраняются на фоне антибактериальной терапии; при обнаружении очагов в легочной ткани (компьютерная томография).
